Производи
Lifecosm комплет за детекцију SARS-Cov-2-RT-PCR за 2019-nCoV
Очекивана употреба
Овај комплет се користи за квалитативно откривање новог коронавируса (2019-nCoV) коришћењем брисева грла, брисева назофаринкса, течности бронхоалвеоларног лаважа, спутума. Резултат детекције овог производа је само за клиничку референцу и не треба га користити као једини доказ за клиничку дијагнозу и лечење. Препоручује се свеобухватна анализа стања у комбинацији са клиничким манифестацијама пацијента и другим лабораторијским тестовима.
Принцип инспекције
Комплет је базиран на једностепеној RT-PCR технологији. У ствари, ORF1ab и N гени новог коронавируса (2019-nCoV) из 2019. године су одабрани као циљни региони за амплификацију. Специфични прајмери и флуоресцентне сонде (N генске сонде су обележене са FAM, а ORF1ab сонде су обележене са HEX) су дизајнирани за детекцију РНК новог типа коронавируса из 2019. године у узорцима. Комплет такође укључује ендогени систем за детекцију интерне контроле (генска сонда интерне контроле обележена са CY5) за праћење процеса прикупљања узорака, амплификације РНК и PCR, чиме се смањују лажно негативни резултати.
Главне компоненте
| Компоненте | Јачина звука(48Т/Комплет） |
| RT-PCR реакциони раствор | 96µl |
| нЦОВ прајмер ТакМан сонда мешавина (ОРФ1аб, Н ген, РнасеП ген) | 864µl |
| Негативна контрола | 1500µl |
| нЦОВ позитивна контрола (л ОРФ1аб Н ген) | 1500µl |
Сопствени реагенси: реагенси за екстракцију или пречишћавање РНК. Негативна/позитивна контрола: Позитивна контрола је РНК која садржи циљни фрагмент, док је негативна контрола вода без нуклеинских киселина. Током употребе, треба да учествују у екстракцији и треба их сматрати инфективним. Треба их руковати и одлагати у складу са релевантним прописима.
Интерни референтни ген је људски RnaseP ген.
Услови складиштења и рок трајања
-20±5℃, избегавајте поновљено замрзавање и одмрзавање више од 5 пута, важи 6 месеци.
Применљиви инструмент
Са FAM / HEX / CY5 и другим вишеканалним флуоресцентним PCR инструментом.
Захтеви за узорке
1. Применљиве врсте узорака: брисеви грла, брисеви назофаринкса, течност бронхоалвеоларног лаважа, спутум.
2. Прикупљање узорака (асептична техника)
Брисе ждрела: Обришите крајнике и задњи зид ждрела са два бриса истовремено, а затим уроните главу бриса у епрувету која садржи раствор за узорковање
Спутум: Након што пацијент дубоко искашље, сакупите искашљани спутум у епрувету са затварачем на завртање која садржи раствор за узорковање; течност за бронхоалвеоларно лаважирање: Узорковање од стране медицинског стручњака. 3. Чување и транспорт узорака
Узорке за изолацију вируса и тестирање РНК треба тестирати што је пре могуће. Узорци који се могу детектовати у року од 24 сата могу се чувати на 4℃; они који се не могу детектовати у року од 24
сати треба да се чувају на -70℃ или ниже (ако нема услова складиштења од -70℃, треба их чувати
привремено складиштено на -20℃ у фрижидеру). Узорке треба избегавати поновљено замрзавање и одмрзавање током транспорта. Узорке треба послати у лабораторију што је пре могуће након сакупљања. Ако је потребно транспортовати узорке на велике удаљености, препоручује се складиштење у сувом леду.
Методе испитивања
1 Обрада узорака и екстракција РНК (област за обраду узорака)
Препоручује се узети 200 μl течног узорка за екстракцију РНК. За кораке екстракције, погледајте упутства комерцијалних комплета за екстракцију РНК. И негативни и негативни
Контроле у овом комплету су биле укључене у екстракцију.
2 Припрема PCR реагенса (просторија за припрему реагенса)
2.1 Уклоните све компоненте из комплета, одмрзните их и промешајте на собној температури. Центрифугирајте на 8.000 о/мин неколико секунди пре употребе; израчунајте потребну количину реагенса и реакциони систем се припрема као што је приказано у следећој табели:
| Компоненте | N порција (систем од 25µl) |
| нЦОВ прајмер ТакМан сонда смеша | 18 µl × N |
| RT-PCR реакциони раствор | 2 µl × N |
| *N = број тестираних узорака + 1 (негативна контрола) + 1 (nCOVпозитивна контрола) | |
2.2 Након темељног мешања компоненти, центрифугирајте кратко време како би сва течност са зида епрувете пала на дно епрувете, а затим аликвотирајте 20 µl система за амплификацију у PCR епрувету.
3 Узорковање (просторија за припрему узорака)
Додати 5 μl негативне и позитивне контроле након екстракције. РНК узорка који се тестира додаје се у PCR реакциону епрувету.
Чврсто затворите епрувету и центрифугирајте је на 8.000 о/мин неколико секунди пре него што је пренесете у подручје за детекцију амплификације.
4 PCR амплификација (амплифицирано подручје детекције)
4.1 Поставите реакциону епрувету у ћелију за узорак инструмента и подесите параметре на следећи начин:
| сцена | Бицикл број | Температура(°C) | Време | колекцијасајт |
| Обрнутотранскрипција | 1 | 42 | 10 мин | - |
| Преденатурацијаn | 1 | 95 | 1 мин | - |
| Бицикл | 45 | 95 | 15 секунди | - |
| 60 | 30-их | прикупљање података |
Избор канала за детекцију инструмента: Изаберите FAM, HEX, CY5 канал за флуоресцентни сигнал. За референтни флуоресцентни сигнал NONE, молимо вас да не бирате ROX.
5 Анализа резултата (Молимо погледајте експериментална упутства сваког инструмента за подешавање)
Након реакције, сачувајте резултате. Након анализе, подесите почетну вредност, крајњу вредност и граничну вредност основне линије према слици (корисник може подесити према стварној ситуацији, почетна вредност се може подесити на 3~15, крајња вредност се може подесити на 5~20, подешавање) на логаритамском графику. На прагу прозора, линија прага је у логаритамској фази, а крива амплификације негативне контроле је права линија или испод линије прага.
6. Контрола квалитета (процедурална контрола је укључена у тест) Негативна контрола: Нема очигледне криве амплификације за FAM, HEX, CY5 канале детекције
COV позитивна контрола: очигледна крива амплификације FAM и HEX канала за детекцију, Ct вредност ≤ 32, али нема криве амплификације CY5 канала;
Горенаведени захтеви морају бити испуњени истовремено у истом експерименту; у супротном, експеримент је неважећи и потребно га је поновити.
7 Утврђивање резултата.
7.1 Ако нема криве амплификације или вредности Ct > 40 у FAM и HEX каналима тестног узорка, а постоји крива амплификације у CY5 каналу, може се проценити да у узорку нема РНК новог коронавируса из 2019. године (2019-nCoV);
.2 Ако тест узорак има очигледне криве амплификације у FAM и HEX каналима, а Ct вредност је ≤40, може се проценити да је узорак позитиван на нови коронавирус из 2019. године (2019-nCoV).
7.3 Ако тест узорак има јасну криву амплификације само у једном каналу FAM или HEX, а Ct вредност је ≤40, а нема криве амплификације у другом каналу, резултате је потребно поново тестирати. Ако су резултати поновног тестирања конзистентни, узорак се може сматрати позитивним за нови
коронавирус 2019 (2019-nCoV). Ако је резултат поновног тестирања негативан, може се проценити да је узорак негативан на нови коронавирус 2019 (2019-nCoV).
Позитивна вредност процене
Метода ROC криве се користи за одређивање референтне CT вредности комплета, а референтна вредност интерне контроле је 40.
Тумачење резултата теста
1. Сваки експеримент треба тестирати на негативне и позитивне контроле. Резултати теста могу се утврдити само када контроле испуњавају захтеве контроле квалитета.
2. Када су FAM и HEX канали за детекцију позитивни, резултат са CY5 канала (канал интерне контроле) може бити негативан због системске конкуренције.
3. Када је резултат интерне контроле негативан, ако су FAM и HEX канали за детекцију епрувете такође негативни, то значи да је систем онемогућен или да је рад погрешан, односно да је тест неважећи. Стога је потребно поново тестирати узорке.
